Cloning, Expression and Modification of Antibody Variable Regions (V Regions)

Summary

PCR-based cloning schemes utilize conserved sequences in the framework and pilot regions of the variable region, and although primers can be synthesized with conserved sequences in the framework region for cloning of the variable region, they cause amino acid changes in the framework region, which can affect antigen binding. Therefore, synthesizing primers with conserved hydrophobic pilot sequences is a better solution.

Operation method

Cloning, Expression and Modification of Antibody Variable Region (V Region)

Move

Basic Option 1 Cloning and Expression of Immunoglobulin Variable Regions by Using Redundant Primers

NOTE: Autoclave all instruments and containers that come into contact with RNA and rinse with DEPC-treated water. Experimentation
Wear gloves at all times during the experiment. All water and salt solutions used for RNA are treated with DEPC (Appendix 1).

材 料 ( 带7 项 目 见 附 录 1) 5X105 个来自能生产抗体的杂交瘤细胞株的细胞( 单 元 1.3) V pbs 液氮,可选择的 V 异硫氰酸胍溶液 V 2mol/L 乙酸钠, pH4 V 水饱和的酚 49 : I (V/V ) 的氯仿/异戊醇 100%和 70% 0//V) 的乙醇,一20°C V 二乙基焦碳酸( DEPC) 处理过的水 lmg/ml用于cDNA合成的3'端 引 物 ( 表 1.8.1) VcDNA第一链缓冲液 50U/V RNA 酶 抑 制 剂 ( RNasin; Promega) 10mmol/L 4dNTP溶于水的混合物
表 1. 8.1 用 于 CDNA合 成 和 抗 体 序 列 的 扩 增 的 3'端引物 免疫球蛋白区域 PCR引物 引物序_列3 轻链恒定区 Oligo dT. Rl. XBA. H3 5’-GCCGGAATTCTAGAAGC (T )17^ 轻链恒定区 MCkAS. XBAb 5 ’-GCGTCT AG A ACTGGATGGTGGG AGATGG A-3 ’ 重链可变区 MgC. ChIASc 5’-AGGTCTAGAA (C yT) CTCCACACACAGG (A/G) (A ,G) CCAGTGGATAGAC- 3, a. 存在兼并性的核_ ff酸,已经在某位置用可替换的核苷指出。底下画截的是Xfe2I 克隆位点。 b. 能与鼠科动物K恒定•区的氨基酸122~116的编码序列杂交的序列。 c. 能与小鼠除IgG3 的免疫球蛋白中ChI 中的氨基酸13.0〜120的编码序列杂交的反义引物 9. 5U/ V1禽成髓性白血病病毒( AMV) 反 转录酶( Promega),1/10稀释于反转录 酶 缓冲液( 附录1) 2〇!wnol/L 针对小鼠的重链和轻链可变区的上游引物( 表 1. 8. 2 和 表 1. 8. 3) 表 1.8. 2 扩 增 鼠 重 链 可 变 区 引 导 区 域 的 5'端正义引物 PCR引物_MHALT1._RV_MHALT2._RV_MHALT3._RV_MHALT4._RV_引物序列b 5 '-GGGG AT ATCCACCT AGGCA/G) ATG(C yG) AGCTG(T/G)GT(C, A) AT(C "GjCTCTT-S’ 5 '-GGGGATATCCACCTAG (A/G) ACTTCGGG(T/C) TGAGCT(T/G ) GGTTTT-37 5 ^ g g g g a t a t c c a c c t a g g c t g t c t t g g g g c t g c t c t t c t -s, 5 ^-GGGGATATCCACCTAGGC A/G) CAG (G/A)CTTAC(T/A)AT(C .T) (T/C)-3' a. 设计的Y端引物为可以同重链引导序列的氨基末端杂交的。所有引物同时应用,用于扩增未知序列。 b.EcaRV位 点 ( 画线处)被 V端的三个鸟嘌呤保护。核糖体结合位点用黑体表示。简并性核苷酸在某位置用 可替换的核苷标出。 PCR引物a MHALT1. RV MHALT2, RV MHALT3. RV MHALT4. RV MHALT5. RV MHALT6. RV 表 1 , 8 . 3 扩 增 鼠 轻 链 可 变 区 引 导 区 域 的 5'端正义引物 引物序列1 5 5 ^ g g g g a t a t c c a c c a t g g a g a c a g a c a c a c t c c t g c t a t -3; 5’-GGGG AT ATCCACC ATGGATTTTC AGGTGC AGATTTTCA03, 5^GGGGATATC CACCATG (G /A) AGTCACA(G/T) AC(T/C)CAGGTCTT(T/C) (G /A)TA-3’ 5 ^GGGGATATC CACCATGAGG (G/T) CCCC(A/T) GCTCAG(C/ T) TC. T() CT(T;G) GG(G/A)-3, 5 ^ g g g g a t a t c c a c c a t g a a g t t g c c t g t t a g g c t g t t g -s' 5/-GGGGATATCCACCATGATGAGTCCTGCCCAGTTCC-3, a. 设计的6 个引物为可以同鼠轻fe引导区域的氨基末端杂交的。所有引物同时应用,用于扩增未知序列。 b.EcoRV位 点 ( 画线处)被 5'端 的 3 个鸟嘌呤保护。核糖体结合位点用黑体表示。简并性核苷酸在某位置用 可替换的核苷标出 2U/M1 Tag DNA 聚合酶 I.25mmol/L 4dNTP溶 于 TE: 每种dNTP浓度为I.25mmol/L并溶于TE缓冲液 中, pH7.5 (附 录 1)。分装成Imi/支,在一20°C可以保存1 年。 V 10 XPCR扩增缓冲液 石蜡油 氯仿 T A 载 体 ( 见辅助方案;也可从Invitrogen购得) 第一章免疫应答导论
I Weiss U/W T4 DNA 连接酶和 2 XT4 DNA 连接酶缓冲液( GIBCO/BRL) 感 受 态 尺 〇 ^细 胞 ( 0?1附录3>0 2(Vmol/L J 区 引 物 ( 表 1.8.4) 表 1 . 8 . 4 扩增和克隆E 可变区的J 区引物 PCR引物 引物序列3 重链J区1 5 J hi JH 2 JH 3 JH 4 JH 5 轻链J区 VLJ 1,2,4 反 义 5^GGGGCTAGCTTACGTTTCT/G)ATTTCCA(G,A)CTT(G/T)GTCCC -3, VLJ 5 反义d,e 5’-GGGGCTAGCTTACGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC-3’ VLJ6 反义 S^GGGGCTAGCTTACGTTTCAATTCCAGCTTGGTG -3, a•简并性核苷酸在某位置用可替换的核苷酸标出。 b.NAeI位 点 ( 下画线处)用于克隆进人表达载体。 C .J« J , L 2 * JK 4 的引物;不会引起氨基酸改变。 d.Sa/I 位 点 ( 下画线处)用于克隆进人表达载体。 ^ 九 5 和 JK 3 的引物是假基因。 用于PCR克隆的重链和轻链可变区的表达载体( 图 1. 8. 2 和 图 1. 8. 3) 用于筛选的加入适当抗生素的LB平 板 ( CPI附录3N) 室温和4°C微量离心机 16°C 、42°C 、 60-C水浴 0. 5ml微量离心管 PCR仪 1•用微量离心机将5X105 个生产抗体的杂交瘤细胞在最大转速离心30s。弃上清,将 细胞沉淀重悬于Iml PBS中,重复离心。再 用 PBS洗一遍。如果有必要的话,将沉 淀迅速冻于液氮中,然后转移至一70°C 中备用。 2 . 在细胞沉淀中加人下列液体,每加一次都颠倒混匀,然后冰浴15min。 0 •5ml异硫氰酸胍溶液 50/^1 的 2mol/L 乙酸钠, pH4 0. 5ml水饱和酚 IOOmI 49 : 1 的氯仿/异戊醇 3_ 4°C ,最大转速离心20min 。将 上 清 ( 水相)层吸至另一干净的L 5mi离心管中。加 入 2 倍体积的一20°C无水乙醇沉淀RNA。样品在一7CTC孵 育 15min以 上 ( 最好过 夜) ,然后4°C ,最大转速离心l〇min。弃上清。 4•加入200fil —20°C 7 0 % 乙醇,短暂的混匀重悬沉淀,然 后 4°C ,最大转速离心 lOmin。弃上清,用乙醇再洗一次。晾 干 RNA沉淀或冷冻干燥1〜2min。将沉淀用
图 1.8. 2 表 达 通 过 PCR克 隆 获 得 的 重 链 ( H) 可 变 区 ( V) 和 人 7 链 恒 定 区 ( C) 的 载 体 。填 充 的 黑 框 表 示 人 重 链 基 因 的 外 显 子 。选 择 性 限 制 性 内 切 核 酸 酶 位 点 在 图 上 多 接 头 位 置 内 标 示 出 , 其 中 包 栝 EcoRV和 NZieI克 隆 位 点 ,外 显 子 下 方 的 箭 头 标 示 了 转 录 的 方 向 。表 达 载体在 位 点 被 线 性 化 ,用 来 表 达 人 基 因 序 列 3'端 的 另 一 个 SawH I位 点 也 已 标 示 出 。此 外 标 示 出 的 PwuJ位 点 位 于 Amp抗 性 区 内 ,通 常 也 可 用 来 线 性 化 表 达 载 体 。真 核 的 选 择 性 标 志 在 构 建图下 方 用 一 箭 头 标 示 ,箭 头 方 向 代 表 了 转 录 的 方 向 。小 鼠 非 编 码 区 用 点 描 的 线 条 表 示 ,启动子 的 位 置用细线条标7TC 。人 非 编 码 区 用 空 白 的 框 表 示 D 位 于 EcoRI克 隆 片 段 处 的 小 鼠 重 链 增 强 子 用 细 线 标 示 。 NAeI和 BamHI位 点 通 常 用 来 交 换 恒 定 区 。 2 0 fxl D E P C 处理过的水重悬。 5■加入9/xl R N A 到 2; xl浓 度 为 lmg/m l用于合成cDNA的 3 '端引物中,在 60°C孵育 lOmin。 将样品放在冰上冷却。开始cDNA合 成 反 应 (反应总体积为2〇^)。 第一条链cDNA缓冲液; Ijxl 50U/W RNA 酶抑制剂; 2jul 10mmol/L 4 种溶于水的dNTP混合物; Zfxl稀释过的禽成髓细胞瘤病毒( AMV) 反转录酶。 42°C孵 育 I h 后立即用于PCR合成 cDNA或将其保存在一2〇 。(: 。 6.加 2/^1上述合成的cDNA和 5/xl合适的小鼠轻链或重链可变区引物至〇• 5ml的微量离 心管中,两种引物应等量。


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